中國報告大廳網(wǎng)訊，生物檢測試劑的擴增性能，尤其是酶試劑的生物活性，對熒光定量 PCR 等檢測結果起著決定性作用。隨著分子生物學與醫(yī)學領域的快速發(fā)展，生物試劑的應用場景不斷拓展，從實驗室延伸至臨床診斷、野外檢測等多個領域。然而，生物試劑中如 DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等活性成分易受溫度、濕度等環(huán)境因素影響，若保藏與運輸條件不當，會導致酶失活、引物探針降解等問題，大幅降低檢測成功率。當前，行業(yè)內(nèi)亟待通過優(yōu)化保藏技術，實現(xiàn)生物試劑室溫下長時間穩(wěn)定保藏與非冷鏈運輸，保障檢測結果的穩(wěn)定性、準確性、特異性和靈敏度，這已成為推動生物試劑行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的關鍵課題。以下是2025年生物試劑行業(yè)技術分析。
《2024-2029年中國生物試劑行業(yè)市場深度研究及發(fā)展前景投資可行性分析報告》指出，生物試劑主要包含引物、探針、三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、Mg2?等成分，不同成分的低溫保藏要求存在差異。一般合成的引物為干粉狀，從有機溶劑中干燥而來，具備無菌、無核酸酶特性，可在室溫或 - 20℃密閉環(huán)境下長期保存，而溶解后的 DNA 則需保存在 - 20℃;TaqMan 探針需避光保存以防止熒光基團降解，干粉狀態(tài)下可在 - 80℃保存一年以上，稀釋為液體后需在 - 20℃保存，且要避免反復凍融;dNTP 由 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 四種基本核苷酸組成，是新 DNA 鏈的組成元件及 PCR 反應必需組分，在常見 PCR 應用中，各種 dNTP 的常用終濃度通常為 0.2 mmol?L?1，一般在 - 20℃保存;DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等酶制劑屬于生物熱敏性物質(zhì)，高溫條件下易失活，通常需在 - 20℃保存，且液體形式的酶制劑穩(wěn)定性較差，保藏周期短，其活性還會受金屬離子濃度、pH 值、溫度等因素影響。
在實際應用中，科學研究常用的商品化生物檢測試劑盒在 - 20℃條件下可保藏 1 年左右，且大部分試劑盒會明確標注反復凍融次數(shù)。生物試劑中的逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA 聚合酶等生物活性物質(zhì)，必須依賴低溫冰箱進行保藏。實驗數(shù)據(jù)表明，當酶的儲存溫度為 - 20℃時，可保存 6 個月以上，而在 37℃保藏條件下，隨著時間延長酶活性會不斷下降。若生物試劑中的酶等成分經(jīng)過較長時間的高溫運輸，或暴露于較高溫環(huán)境中，可能導致實驗結果出現(xiàn)假陰性等不良后果;同時，實驗操作人員在保藏試劑過程中若反復凍融，也會引發(fā)較大實驗誤差。因此，為保證酶的活性，必須確保生物試劑在低溫條件下進行保藏與運輸。
鑒于低溫保藏在生物試劑運輸與操作方面的不便，常溫保藏方法逐步發(fā)展起來。要維持 qPCR 等生物檢測試劑在常溫保藏和運輸中的生物活性，關鍵在于去除試劑中的水分，減少各反應組分在保藏過程中可能發(fā)生的物理、化學變性及降解反應。目前，去除生物試劑中水分的方式主要有兩種：一種是針對一般非生物活性試劑的加熱干燥處理，但加熱過程可能導致生物活性物質(zhì)失活;另一種是真空冷凍干燥技術(簡稱 “凍干”)，該技術先將液態(tài)生物試劑冷凍，再將其置于密閉環(huán)境中，在近真空條件下使液態(tài)水升華成氣態(tài)水，從而實現(xiàn)水分去除。
真空冷凍干燥技術的流程主要包括三個階段：首先是預凍處理，將生物試劑放置在低溫冰箱中，使溶液中的自由水預先冷凍到固態(tài);其次是升華干燥，在真空條件下通過升華作用去除生物試劑中的固態(tài)水，這是凍干過程中水分去除的主要階段，升華干燥速率會通過影響水蒸氣逸出快慢，進而影響生物試劑的內(nèi)部結構，升華干燥完成后仍會殘留 10% 左右的水分，包括自由水和結合水;最后是解析干燥，在真空條件下通過解析作用去除升華干燥未除盡的水分，由于結合水的解析需要較高能量和推動力，此階段設置的溫度需在不影響試劑的前提下盡可能高，真空度盡可能低，解析完成后試劑中可能仍存在 1% 左右的殘留水分。
該技術因全程在低溫下進行，能最大程度降低對酶等熱敏性生物活性物質(zhì)的損害，應用范圍廣泛。實驗數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)真空冷凍干燥處理的核酸檢測試劑，在 20℃密封保藏條件下，檢測性能與未凍干液態(tài)檢測試劑無明顯差異;全預混草魚呼腸孤病毒 Ⅱ 型一步法凍干檢測試劑，4℃可保存 12 個月，室溫 25℃可保存 3 個月，37℃可保存 15 天，實現(xiàn)了常溫運輸和短時間保存;分枝桿菌核酸檢測試劑預混液經(jīng)凍干處理后，在 4℃或 20℃保存 1 年，或在 37℃保存 3 個月，仍能保持較高活性;橡樹猝死病核酸檢測試劑凍干后，室溫保存 20 周，活性依舊維持在較高水平。此外，真空冷凍干燥技術在生物制藥領域應用廣泛，大幅提升了制藥效率，在疫苗研發(fā)與生產(chǎn)中也發(fā)揮重要作用，如改進水痘減毒活疫苗冷凝分裝工藝制備穩(wěn)定一致的冷凝疫苗、通過重組慢病毒載體凍干制備無需冷凍保存的病毒基因載體、研發(fā)乳頭狀瘤病毒凍干粉末疫苗，且該疫苗能實現(xiàn)與市面上人乳頭狀瘤病毒疫苗相同的免疫原性，可常溫儲存和運輸。
不過，真空冷凍干燥技術也存在不足：生物試劑凍干過程中可能出現(xiàn)擴增性能下降，主要因酶試劑在凍干過程中失活，需添加海藻糖、蔗糖或葡聚糖等凍干保護劑維持生物活性，且保護劑的篩選與驗證對凍干試劑檢測性能至關重要;試劑脫水后有效物質(zhì)殘留少，呈粉末狀，轉(zhuǎn)移困難，凍干過程中可能需添加聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或山梨醇等賦形劑，而賦形劑對預混裝試劑檢測性能的影響仍需進一步驗證。
噴霧干燥技術的原理是通過霧化器將液體分散為細小顆粒，霧滴在干燥熱介質(zhì)空間中蒸發(fā)水分，最終得到干粉物質(zhì)，主要分為三個步驟：一是霧化，利用霧化器將液料霧化形成微小霧滴;二是干燥，霧滴與熱空氣直接接觸，迅速蒸發(fā)干燥;三是分離，對干燥顆粒進行分離和收集。目前常用的霧化器主要有壓力式噴霧器、氣流式噴霧器、離心式噴霧器等類型。
噴霧干燥技術具有顯著特點：霧化后霧滴體積大幅增大，與高溫空氣接觸瞬間可實現(xiàn) 90%~95% 以上的水分蒸發(fā)，根據(jù)設備差異，干燥時間可在 5~30 秒內(nèi)，能實現(xiàn)物料迅速干燥且不受高溫影響;針對熱敏性物料，在噴霧干燥時，物料與熱空氣直接接觸，但多數(shù)熱量用于蒸發(fā)水分，物料溫度不會超過高溫空氣濕球溫度，也不會受高溫空氣影響，能保證質(zhì)量品質(zhì);適用于從高級合成物到化學品的生產(chǎn)，可處理料液固含量在 0~60% 的含固物料干燥過程，通過調(diào)整工藝參數(shù)，能高效生產(chǎn)出滿足粉末顆粒大小、形狀、密度、分散性、多態(tài)性及流動性等精準特性的高質(zhì)量粉末。
當前，生化醫(yī)療領域產(chǎn)品加工行業(yè)常用的真空冷凍干燥法可能導致生物材料孔層塌陷，影響其理化結構，而噴霧干燥法可避免這一問題。但現(xiàn)有噴霧干燥技術的干燥溫度會對生物試劑活性產(chǎn)生影響，高溫噴霧法及亞高溫噴霧法溫度均大于 60℃，常溫噴霧法進口溫度為 0~60℃，且常溫噴霧法存在干燥動力小、除濕難度大的問題。因此，在生物試劑保藏方面，噴霧干燥技術可結合冷凍干燥，降低干燥試劑的能耗。除傳統(tǒng)噴霧干燥技術外，近年來針對不同領域還出現(xiàn)了節(jié)能噴霧、冷凍噴霧、納米噴霧和過熱蒸汽噴霧等新型噴霧干燥技術。其中，噴霧冷凍干燥技術是近年發(fā)展的微粉化新技術，結合了真空冷凍干燥技術和噴霧干燥技術的優(yōu)勢，適用于蛋白質(zhì)和肽類等性質(zhì)不穩(wěn)定成分的微粉化處理，能縮短冷凍和干燥時間，獲得孔隙率高、生物活性高的粉末產(chǎn)品，在食品、醫(yī)藥等領域應用廣泛。例如，利用該技術生產(chǎn)全脂奶粉，可有效縮短干燥時間，獲得高孔結構奶粉粉體;制備的魚油微膠囊顆粒粒徑集中分布在 117.13~200.06μm，與傳統(tǒng)噴霧干燥制備的魚油微膠囊產(chǎn)品相比，質(zhì)量更優(yōu)。
在醫(yī)藥領域，噴霧冷凍干燥技術常被應用于藥物研究，如研制治療骨質(zhì)疏松癥的激素類藥物鮭魚降鈣素;通過優(yōu)化噴霧干燥工藝制備柚苷酶固體酶制劑，所得酶制劑中鼠李糖苷酶活力達 19000 U?g?1，酶活總回收率為 78.1%，柚苷酶活力達 4700 U?g?1，酶制劑含水量 6.5%;利用噴霧干燥技術制備固態(tài)植酸酶制劑，植酸酶的酶活回收率可達 80%。噴霧干燥技術已成為酶制劑干燥領域應用最廣泛的技術之一，采用噴霧冷凍干燥技術可生產(chǎn)出生物活性高、可溶性好、粒徑可控的多種產(chǎn)品，在醫(yī)藥領域應用前景廣闊。但該技術也存在不足，主要包括能耗高、設備昂貴且體積大、結構復雜、操作不靈活、易粘壁等，后續(xù)還需開展該技術對 DNA 聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶生物活性影響的研究，為生物試劑保藏提供更多思路。
目前，疫苗、免疫血清、免疫球蛋白、抗原及生物酶等生物制品多以溶液形式生產(chǎn)，這些生物試劑在常溫條件下極易發(fā)生蛋白質(zhì)快速降解，導致生物活性大幅降低。真空冷凍干燥技術的凍干過程中，試劑需承受多種應力，這些應力常直接或間接導致蛋白質(zhì)活性不穩(wěn)定，而玻璃化冷凍技術為解決這一問題提供了新途徑。
玻璃化冷凍技術中的玻璃化，是指在一定降溫速率下，液態(tài)物質(zhì)直接轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡЩ腆w狀態(tài)的過程，此過程中不會生成晶體結構，還能保持液相時期分子及離子的分布，且在冷凍和解凍過程中不會在液態(tài)和晶體之間來回變化，其力學性質(zhì)與玻璃相似，故稱為玻璃態(tài)，這是一種介于液態(tài)與固態(tài)之間的狀態(tài)。發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變時對應的溫度稱為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)，要保持制品的玻璃態(tài)，需將其儲存在低于或等于該物質(zhì) Tg 的環(huán)境中，若制品的 Tg 高于室溫，則有望實現(xiàn)室溫下較長時間的穩(wěn)定保存。
在蛋白質(zhì)生物藥物領域，利用玻璃化冷凍技術可延長藥品貯存時間，實現(xiàn)非冷鏈條件下的穩(wěn)定保藏。例如，加入海藻糖等保護劑，采用玻璃化冷凍技術生產(chǎn)的疫苗，能在極端溫度下保藏;使用海藻糖等凍干保護劑、蛋氨酸和明膠等，通過玻璃化冷凍技術研制的熱穩(wěn)定減毒活沙門氏菌 Ty21a 細菌疫苗，在 37℃條件下可穩(wěn)定儲存約 12 周，該技術不僅提高了活 Ty21a 疫苗的溫度穩(wěn)定性，還增強了產(chǎn)品的免疫原性，有效延長了疫苗保質(zhì)期，實現(xiàn)了疫苗常溫儲存和運輸，為不發(fā)達地區(qū)使用疫苗提供了極大便利。
在生物試劑保藏方面，生物酶通常是與甘油按一定比例混合后在低溫條件下保藏，應用玻璃化冷凍技術可改善酶試劑的保藏條件。實驗數(shù)據(jù)顯示，使用 Ficoll400 和松三糖等試劑研制的玻璃化限制性內(nèi)切酶，可在室溫或 37℃條件下穩(wěn)定保藏 4 個月;研制的克隆小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶與 Klenow 酶，可在室溫條件下保藏，且能在 30 秒內(nèi)復溶于水，研究表明其 Tg 至少為 40℃(45℃為最佳)，才能保證制品在室溫下的穩(wěn)定性;以海藻糖作為保護劑，利用玻璃化冷凍技術研制的乳酸鹽脫氫酶，可在 60℃條件下穩(wěn)定保藏 4 周。
玻璃化冷凍技術在玻璃化期間也需添加海藻糖等凍干保護劑，以防止酶結構劇烈變化，維持生物制品高活性，延長穩(wěn)定保藏時間，降低冷鏈保藏及運輸?shù)慕?jīng)濟成本。該技術目前在細胞與胚胎、組織和器官中的應用也較多，例如對人體大型卵巢組織進行玻璃化冷凍，經(jīng)形態(tài)學分析、凋亡檢測及免疫組織化學方法檢測解凍后的卵泡活性發(fā)現(xiàn)，玻璃化組與程序冷凍組在解凍后原始卵泡比例、正常形態(tài)及卵泡凋亡率方面無統(tǒng)計學差異，且玻璃化組間質(zhì)細胞凋亡率低于程序冷凍組。玻璃化冷凍技術具有操作步驟簡便、儲存穩(wěn)定性好、復蘇率高等優(yōu)勢，此外，在低毒性保護劑濃度和較高降溫速度的前提下優(yōu)化玻璃化制品的 Tg，即可實現(xiàn)制品常溫儲存，這對該技術的進一步發(fā)展和應用具有重要意義。
目前，大部分生物試劑行業(yè)仍需依賴專門的冷鏈運輸，相關設備復雜、成本高昂、運輸耗時，對于交通落后地區(qū)，難以實現(xiàn)空運。若遭遇重大緊急疫情爆發(fā)，很可能因冷鏈運輸資源緊張、運輸費時或疫區(qū)交通不便，導致試劑供應不及時。冷凍保藏作為一項重要手段，在生物、醫(yī)學領域?qū)ι镌噭?、細胞或組織等的保藏中仍發(fā)揮著重要作用。因此，選擇合適的保藏技術手段，對于生物試劑的運輸、維持活性物質(zhì)的生物活性、保證檢測質(zhì)量及穩(wěn)定性具有重要意義。
隨著分子生物學檢測技術應用日益廣泛，生物試劑保藏問題備受關注，真空冷凍干燥技術、噴霧冷凍干燥技術和玻璃化冷凍技術等保藏技術應運而生，實現(xiàn)了生物試劑的常溫穩(wěn)定保存，解決了生物試劑低溫儲存和運輸?shù)南拗啤５鋬龈稍镞^程中，冷凍階段、干燥階段以及凍干后的試劑保藏過程相對復雜，其中冷凍階段冰 - 水界面形成、速凍等均可能導致蛋白質(zhì)變性 / 降解反應增加，不可避免地對生物試劑中部分生物活性物質(zhì)造成損傷;此外，干燥階段可能導致酶等蛋白質(zhì)周圍水分去除后，天然構象發(fā)生變化，進而影響其生物活性。
生物試劑中的 DNA 聚合酶可耐高溫，具有高度熱穩(wěn)定性，凍干后穩(wěn)定性較易維持;而逆轉(zhuǎn)錄酶不耐受高溫、穩(wěn)定性較差，凍干后維持長期保藏的難度較大。同時，生物試劑中的引物、探針為寡核苷酸片段，保藏不當會導致其降解。目前，引物 / 探針凍干粉形式的生產(chǎn)工藝已相對成熟，廣泛應用于實驗室科研和臨床診斷中，大部分商品化的核酸提取試劑盒(磁珠法)中也使用了可常溫保藏凍干粉形式的蛋白酶 K，避免了酶在長時間的高溫運輸或者由于操作 / 保藏不當暴露于較高溫度環(huán)境下，可能造成實驗結果出現(xiàn)假陰性等不良后果。
商品化的 DNA 聚合酶 / 逆轉(zhuǎn)錄酶一般需要添加甘油后在 - 20℃低溫保藏，運輸過程依賴冷鏈運輸。目前，核酸檢測試劑多數(shù)為酶混合液與核酸擴增反應液分開包裝，部分商品化試劑盒以一管式預混液形式存在，但均為液體形式，無法實現(xiàn)常溫保藏及運輸。而且在 - 20℃低溫保藏條件下，除酶以外多為冷凍固態(tài)，實驗過程中需解凍，且試劑的配制較為復雜繁瑣，實驗人員操作不當極易引起試劑漏加、交叉污染等情況，因此正規(guī)的核酸檢測實驗室會設置分區(qū)，由專業(yè)人員進行實驗操作。此外，各反應組分尤其是引物、探針和酶用量較少，對移液器的精準度要求高，且試劑配制完成后需將其混勻或借助離心機回收吸附在管壁上的液體。
目前，盡管有一些商品化的生物試劑以混合形式存儲在一個反應管中，稱為 “預混裝”，以簡化操作，但這種儲存方式并非每個反應組分的最佳儲存環(huán)境，其性能和穩(wěn)定性也會受到一定程度的影響。例如，保存在 “預混裝” 試劑中的酶可能會因失去甘油的保護而變性失活或降解;引物和探針可能會因稀釋而導致在儲存過程中降解速度高于原本高濃度的 “母液” 形式;此外，“預混裝” 中包含了除核酸模板以外 qPCR 所需的全部成分，可能會引起無模板情況下的非特異性擴增反應。為最大程度地維持酶的生物活性，備選方法是將 PCR 試劑與酶分開儲存，使用 “半預混裝” 的方式，但除酶以外的 PCR 試劑并不能在最優(yōu)條件下保存，其活性仍然受到一定程度的影響。在操作過程中，雖然試劑添加步驟相對減少，但操作者仍需將酶與 “半預混裝” 試劑混合在一起，且酶的用量非常少，因此仍需依賴精確的移液器進行操作，同時混合之后仍需混勻處理。由此可知，當前生物試劑的保藏技術大部分為低溫儲藏，在低溫保藏條件下，液態(tài)生物試劑實驗過程中需要考慮人員的專業(yè)性和嚴謹性，且操作步驟較為復雜，一定程度上限制了核酸檢測技術的發(fā)展以及在非實驗室檢測環(huán)境開展檢測活動。
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