中國(guó)報(bào)告大廳網(wǎng)訊，護(hù)肝片作為一款源自經(jīng)典方劑化裁而來(lái)的藥物，由柴胡、茵陳、五味子等多味藥材組成，具有疏肝理氣、健脾消食、降低轉(zhuǎn)氨酶等功效，在脂肪肝、慢性肝炎、藥物性肝損傷等疾病的治療中有著確切作用。然而，當(dāng)前其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)存在單一性，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制也尚未完全明確，這在一定程度上限制了其臨床療效的進(jìn)一步提升。因此，對(duì)護(hù)肝片關(guān)鍵質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行深入研究，對(duì)于提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和臨床應(yīng)用價(jià)值具有重要意義。
《2025-2030年中國(guó)護(hù)肝片行業(yè)市場(chǎng)調(diào)查研究及投資前景分析報(bào)告》指出，護(hù)肝片的重要指標(biāo)成分確定，遵循君臣佐使的配伍原則。君藥柴胡在煎煮過(guò)程中，其含有的柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷 d 會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，生成柴胡皂苷 b?，且前期研究未檢測(cè)到柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷 d，故將柴胡皂苷 b?作為重要指標(biāo)成分;君藥茵陳的指標(biāo)成分為綠原酸，臣藥板藍(lán)根的指標(biāo)成分為(R,S)- 告依春。臣藥五味子中，五味子醇甲、五味子酯甲是規(guī)定的指標(biāo)性成分，聯(lián)苯環(huán)烯辛木脂素類成分為其特征性成分，五味子甲素作為該類成分的直接前體，其結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)生的五味子醇甲、五味子醇乙和五味子丙素也被納入重要指標(biāo)成分。佐使藥豬膽粉基于有效性原則選擇甘氨豬去氧膽酸作為指標(biāo)成分，而綠豆因未發(fā)現(xiàn)專屬性成分未選入。綜上，確定了護(hù)肝片的 9 種重要指標(biāo)成分：柴胡皂苷 b?、綠原酸、(R,S)- 告依春、五味子甲素、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子醇乙、五味子丙素、甘氨豬去氧膽酸。
為測(cè)定這 9 種成分的含量，建立了相應(yīng)的方法。色譜條件為：采用 Themo Syncronis C??色譜柱(250mm×4.6mm 5μm)，流動(dòng)相為 0.3% 磷酸水溶液(A)- 乙腈(B)，進(jìn)行梯度洗脫，柱溫 35℃，流速 1mL?min?1，檢測(cè)波長(zhǎng) 200nm 和 250nm，進(jìn)樣量 10μL。對(duì)照品溶液制備時(shí)，取各對(duì)照品適量，精密稱定后加甲醇配制成儲(chǔ)備液，再配制成混合對(duì)照品溶液。供試品溶液制備方面，單味藥參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法，中間體及成藥則取適量樣品，加 70% 甲醇超聲提取后處理得到。方法學(xué)考察顯示，9 種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的 RSD 均符合要求，加樣回收率在 95.1%~105% 之間，表明該方法準(zhǔn)確可靠。
通過(guò)測(cè)定 9 種指標(biāo)成分在護(hù)肝片處方藥材、中間體、成藥中的含量，計(jì)算其在藥材 - 中間體 - 成藥制備過(guò)程中的轉(zhuǎn)移率，以明確符合量值傳遞規(guī)律的潛在質(zhì)量標(biāo)志物。轉(zhuǎn)移率計(jì)算公式為：轉(zhuǎn)移率(%)=W/M×100%，其中 M、W 分別表示指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移前、后的質(zhì)量。
結(jié)果顯示，14 批護(hù)肝片成藥中柴胡皂苷 b?、(R,S)- 告依春、甘氨豬去氧膽酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別在 0.0088%~0.011%、0.0026%~0.0061%、0.71%~0.91%，從藥材至成藥的平均轉(zhuǎn)移率分別為(23.4±11)%、(22.6±13)%、(59.8±8.9)%，平均轉(zhuǎn)移率均大于 20%，且轉(zhuǎn)移率均在均值 ±3SD 范圍內(nèi)，可穩(wěn)定傳遞。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子丙素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別在 0.14%~0.18%、0.042%~0.049%、0.011%~0.014%、0.023%~0.031%、0.051%~0.072%，從藥材至成藥的平均轉(zhuǎn)移率分別為(7.7±3.1)%、(8.14±3.2)%、(5.20±2.2)%、(6.73±3.0)%、(5.77±2.0)%，轉(zhuǎn)移率小于 20%。但這 5 種成分均來(lái)源于五味子，考慮到其在五味子中的占比及含量，即使轉(zhuǎn)移率較低，可能通過(guò)數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)對(duì)整體藥效產(chǎn)生影響，故將其作為潛在的組合質(zhì)量標(biāo)志物，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為 0.22%~0.28%，從藥材至成藥的平均轉(zhuǎn)移率為(7.39±3.0)%。綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為 0.090%~0.14%，轉(zhuǎn)移率為(2.65±1.4)%，轉(zhuǎn)移率較低，不建議作為潛在質(zhì)量標(biāo)志物。因此，基于質(zhì)量標(biāo)志物 “傳遞性” 要求，確定柴胡皂苷 b?、(R,S)- 告依春、五味子成分組合物(五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子丙素)、甘氨豬去氧膽酸為護(hù)肝片潛在質(zhì)量標(biāo)志物。
以 14 批樣品中柴胡皂苷 b?、(R,S)- 告依春、五味子成分組合物、甘氨豬去氧膽酸的峰面積為變量進(jìn)行主成分分析。主成分分析得分圖顯示，不同批次間質(zhì)量標(biāo)志物含量無(wú)明顯差異，表明 14 批護(hù)肝片樣品質(zhì)量穩(wěn)定。以累計(jì)貢獻(xiàn)率 > 80% 作為判定依據(jù)，提取到 3 個(gè)主成分，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為 89.05%，表明這 3 個(gè)主成分可以代表 89.05% 的質(zhì)量標(biāo)志物峰面積信息。根據(jù)各成分色譜峰面積在 3 個(gè)主成分上的載荷值，柴胡皂苷 b?、甘氨豬去氧膽酸是對(duì)第一主成分影響較大的特征向量，主要與柴胡和豬膽粉有關(guān);五味子成分組合物是對(duì)第二主成分影響較大的特征向量，主要與五味子有關(guān)。結(jié)合潛在質(zhì)量標(biāo)志物篩選結(jié)果，發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷 b?、甘氨豬去氧膽酸和五味子成分組合物是對(duì)護(hù)肝片整體質(zhì)量影響較大的指標(biāo)成分。
以護(hù)肝片行業(yè)治療的常見(jiàn)肝病為疾病模型，建立相關(guān)網(wǎng)絡(luò)并獲得重疊靶點(diǎn)，根據(jù)相互作用建立蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，選擇 AKT1 和 JUN 作為候選蛋白靶點(diǎn)。通過(guò)表面等離子體共振技術(shù)驗(yàn)證關(guān)鍵質(zhì)量標(biāo)志物與這兩個(gè)靶點(diǎn)的結(jié)合情況。
實(shí)驗(yàn)確定 AKT1 和 JUN 蛋白在芯片上偶聯(lián)的最佳 pH 值為 4.0。檢測(cè)結(jié)果顯示，柴胡皂苷 b?、甘氨豬去氧膽酸、五味子甲素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯甲與 AKT1 的親和動(dòng)力學(xué)參數(shù) KD 值分別為 0.0349、3230、0.737、0.0659、0.248、441、0.474μmol?L?1，與 JUN 的親和動(dòng)力學(xué)參數(shù) KD 值分別為 0.0387、3.45、198、382、105、0.0395、0.643μmol?L?1?；?AKT1 靶點(diǎn)蛋白，親和力強(qiáng)的指標(biāo)成分包括柴胡皂苷 b?、五味子丙素、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素，五味子醇乙、甘氨豬去氧膽酸親和力較弱;基于 JUN 靶點(diǎn)蛋白，親和力強(qiáng)的指標(biāo)成分包括柴胡皂苷 b?、五味子醇乙、五味子酯甲、甘氨豬去氧膽酸，五味子醇甲、五味子甲素、五味子丙素親和力較弱。
本研究通過(guò)對(duì)護(hù)肝片9種重要指標(biāo)成分的含量測(cè)定，分析其在藥材 - 中間體 - 成藥過(guò)程中的量值傳遞規(guī)律，確定了潛在質(zhì)量標(biāo)志物。結(jié)合主成分分析篩選出對(duì)護(hù)肝片整體質(zhì)量影響較大的成分，并利用表面等離子體共振技術(shù)驗(yàn)證了這些成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的親和力。最終發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷 b?、甘氨豬去氧膽酸為護(hù)肝片關(guān)鍵質(zhì)量標(biāo)志物，五味子甲素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲為護(hù)肝片組合質(zhì)量標(biāo)志物。該研究為提升護(hù)肝片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)，有助于更好地控制護(hù)肝片行業(yè)的生產(chǎn)質(zhì)量，保障其臨床療效。同時(shí)，研究也存在一定局限性，如樣品選擇代表性有限，未體現(xiàn)下游生物效應(yīng)的表達(dá)情況，后續(xù)將進(jìn)一步拓展研究以完善相關(guān)結(jié)果。
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